ГОСТ 31747-2012

Общие сведения

ГОСТ 31747-2012 — межгосударственный стандарт, устанавливающий методы выявления и количественного определения бактерий группы кишечных палочек (БГКП, колиформных бактерий) в пищевых продуктах. Стандарт введён в действие 1 июля 2013 года Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии № 178-ст от 29 ноября 2012 года.

Статус: действующий межгосударственный стандарт (страны-участницы ЕАЭС, СНГ). Разработан ГНУ ВНИИМП им. В.М. Горбатова Россельхозакадемии при участии ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в г. Москве». Внесён Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстандарт).

Стандарт гармонизирован с международными требованиями в части базовых принципов микробиологического анализа, однако имеет национальную специфику в определении термина «колиформные бактерии» и методике подтверждения.

Область применения

Стандарт распространяется на следующие категории пищевых продуктов:

молоко и молочные продукты (включая кисломолочные, творог, сыры);
мясо и мясные продукты (включая субпродукты, полуфабрикаты, колбасные изделия);
рыба, нерыбные объекты промысла и продукты их переработки;
яйца и яйцепродукты (меланж, яичный порошок);
кондитерские изделия (включая кремовые, с заварным кремом);
напитки (безалкогольные, слабоалкогольные, соки, нектары);
масложировая продукция (майонезы, соусы, маргарины);
продукты детского и диетического питания;
пищевые концентраты, специи, пряности;
хлебобулочные изделия с начинками;
кулинарная продукция общественного питания;
питьевая вода (расфасованная в ёмкости), лед пищевой.

Не распространяется на: сухие продукты с низкой активностью воды (aw < 0,85), замороженные продукты перед размораживанием (анализ проводится после оттаивания), продукты с выраженными антибактериальными свойствами (требуют специальной пробоподготовки), а также на продукты, для которых в нормативных документах установлены иные методы контроля (например, молочные консервы — по ГОСТ 34454).

Термины и определения

Бактерии группы кишечных палочек (БГКП)

Группа грамотрицательных, оксидазоотрицательных, не образующих спор палочковидных бактерий, сбраживающих лактозу с образованием кислоты и газа при температуре (36±1)°С в течение 24-48 часов, обладающих способностью ферментировать глюкозу. Включают роды: Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Hafnia и другие представители семейства Enterobacteriaceae.

Колиформные бактерии (термин стандарта)

В контексте ГОСТ 31747-2012 под колиформными бактериями понимаются бактерии, соответствующие следующим критериям:

грамотрицательные палочки;
оксидазоотрицательные;
сбраживающие лактозу с образованием кислоты и газа при (36±1)°С за 24-48 ч;
не образующие спор.

Важно: в стандарте не требуется подтверждение способности ферментировать лактозу при 44°С (отличие от определения Escherichia coli).

Выявление (качественный метод)

Процедура, устанавливающая наличие или отсутствие БГКП в заданной навеске продукта (обычно 0,1 г, 0,01 г, 0,001 г) без количественной оценки.

Определение количества (количественный метод)

Процедура, устанавливающая число колониеобразующих единиц (КОЕ) БГКП в 1 г (см³) продукта с использованием посева на плотные или жидкие среды.

НВЧ (наиболее вероятное число)

Статистическая оценка количества микроорганизмов в образце, полученная на основе числа положительных пробирок при посеве серийных разведений в жидкую среду. Используется таблица НВЧ (таблица Мак-Креди) с доверительными пределами 95%.

Сущность методов

Стандарт предусматривает три альтернативных метода, выбор которых зависит от целей анализа, типа продукта и оснащения лаборатории:

Метод 1: Посев на плотные селективные среды (количественный)

Принцип: посев определённого объёма продукта (или его разведений) на поверхность плотной селективной среды (агар Эндо, агар Левина, в качестве альтернативы — хромогенные среды). После инкубации при (36±1)°С в течение 24-48 ч подсчитывают характерные колонии (тёмно-красные с металлическим блеском на среде Эндо — типичные для E. coli; розовые — для других БГКП). Для подтверждения принадлежности к БГКП проводят:

проверку оксидазной активности (БГКП — оксидазоотрицательные);
микроскопию мазков по Граму (грамотрицательные палочки);
пересев на скошенный мясопептонный агар для подтверждения ферментации лактозы с газообразованием в среде с лактозой (среда Гисса с поплавком) или в среде Кесслер.

Результат выражают в КОЕ/г (см³).

Метод 2: Посев в жидкие селективные среды (НВЧ-метод)

Принцип: посев серийных десятикратных разведений продукта (обычно 3-5 разведений, по 3-5 пробирок на каждое) в среду Кесслер (лактозно-пептонная среда с поплавком) или среду с лактозой и бриллиантовым зелёным. Инкубация при (36±1)°С в течение 24-48 ч. Положительными считаются пробирки с помутнением и газообразованием (не менее 10% объёма поплавка). Из положительных пробирок делают высев на среду Эндо для подтверждения. Подсчёт НВЧ — по таблице Мак-Креди.

Результат выражают в НВЧ/г (см³).

Метод 3: Качественное выявление (альтернативный)

Применяется для продуктов, в которых БГКП должны отсутствовать в определённой навеске (например, 0,1 г). Посев навески в жидкую среду обогащения (среда Кесслер), инкубация 24-48 ч, затем пересев на плотную среду (Эндо) и подтверждающие тесты. Результат: «обнаружены» или «не обнаружены» в навеске.

Аппаратура, материалы, реактивы

Оборудование

Термостаты с поддержанием температуры (36±1)°С;
Микроскоп биологический с иммерсионной системой;
pH-метр (точность ±0,1 ед.);
Весы лабораторные (погрешность ±0,01 г);
Гомогенизатор (гомогенизатор перистальтический или коллоидная мельница) для приготовления гомогената;
Автоклав (стерилизация при 121°С);
Сушильный шкаф (стерилизация посуды при 160-170°С);
Водяная баня (для расплавления агара);
Стерильные пипетки (1, 5, 10 см³), чашки Петри (90-100 мм), пробирки, колбы, шпатели Дригальского (стеклянные или одноразовые);
Счетчик колоний (лупа с подсветкой, автоматические счётчики);
pH-индикаторная бумага.

Питательные среды (основные)

Среда Кесслер (лактозно-пептонная среда с поплавком) — жидкая селективная среда для НВЧ-метода.
Агар Эндо — плотная селективная среда; содержит лактозу, фуксин, сульфит натрия. Колонии E. coli — тёмно-красные с металлическим блеском; Enterobacter, Klebsiella — розовые, слизистые; Citrobacter — бледно-розовые.
Агар Левина (среда с эозином и метиленовым синим, EMB-агар) — альтернативная среда; E. coli — тёмно-фиолетовые с чёрным центром и металлическим блеском; другие БГКП — розовые/бесцветные.
Хромогенные среды (например, Chromocult Coliform Agar) — допускаются как альтернатива при условии валидации; позволяют дифференцировать E. coli (синие/фиолетовые колонии) и прочие колиформы (розовые/красные).
Среда Гисса с лактозой (с поплавком) — для подтверждения ферментации лактозы с газообразованием.
Мясопептонный агар (МПА) — для контроля чистоты культур и пересевов.
Реактив Ковача — для определения индола (вспомогательный тест при идентификации E. coli).
Реактив на оксидазу (1% раствор N,N-диметил-п-фенилендиамина дигидрохлорида) — для оксидазного теста.

Растворы и реактивы

Физиологический раствор (0,85% NaCl) — для разведений;
Раствор Рингера (модифицированный) — для разведений (рекомендуется для молочных продуктов);
96% этиловый спирт — для микроскопии;
Красители для окраски по Граму (генциановый фиолетовый, раствор Люголя, 96% спирт, сафранин/фуксин);
Иммерсионное масло.

Все среды готовятся согласно инструкциям производителя или прописям, указанным в Приложении А стандарта. Контроль качества сред — с использованием референс-штаммов: E. coli (например, АТСС 25922), Enterobacter aerogenes (АТСС 13048), Citrobacter freundii (АТСС 43864).

Отбор проб и подготовка к анализу

Отбор проб

Отбор проб — по ГОСТ 31904 (для пищевых продуктов) или по нормативной документации на конкретный вид продукта. Пробы отбираются стерильно в стерильные ёмкости. Масса пробы — не менее 100 г (для жидких — 100 см³). Транспортировка при температуре от 2 до 8°С (для скоропортящихся продуктов) или при температуре, установленной для конкретного продукта. Время от отбора до начала анализа — не более 24 часов (для скоропортящихся — не более 6 часов).

Подготовка проб

Твёрдые продукты: навеску (10±1) г помещают в стерильный пакет гомогенизатора, добавляют 90 см³ разбавителя (физиологический раствор или раствор Рингера). Гомогенизируют 1-2 минуты (для жирных продуктов — до 3 минут). Получают исходное разведение 1:10.
Жидкие продукты (молоко, соки, напитки): тщательно перемешивают, отбирают 10 см³ и вносят в 90 см³ разбавителя.
Сыпучие продукты (мука, сахар, сухое молоко): навеску растворяют в разбавителе, выдерживают 10-15 минут для гидратации.
Замороженные продукты: размораживают при температуре (4±2)°С в течение не более 18 часов или при (20±2)°С в течение не более 3 часов.
Продукты с высокой кислотностью (pH < 4,5): доводят pH до 6,5-7,0 стерильным раствором NaOH (1 моль/дм³).
Продукты с консервантами: используют разбавитель с нейтрализаторами (0,5% раствор Твин-80, 0,3% раствор лецитина — для продуктов с сорбатом калия).

Приготовление разведений

Из исходного разведения 1:10 готовят серию десятикратных разведений (10⁻², 10⁻³ и т.д.) стерильными пипетками. Каждое разведение тщательно перемешивают на вортексе не менее 5 секунд. Разведения используют в течение 15-30 минут после приготовления.

Проведение анализа

Метод 1 (количественный, посев на плотные среды)

Этап 1: Посев. Из каждого выбранного разведения (обычно 2-3 последовательных) отбирают по 1 см³ и вносят в стерильную чашку Петри (для каждого разведения — не менее 2 параллельных чашек). Заливают 12-15 см³ расплавленного и охлаждённого до (45±1)°С агара Эндо. Осторожно перемешивают вращательными движениями. После застывания чашки переворачивают вверх дном.

Альтернативно: посев 0,1 см³ на поверхность подсушенного агара с распределением шпателем Дригальского.

Этап 2: Инкубация. Чашки инкубируют при (36±1)°С в течение (24±2) часов. При отсутствии роста — дополнительно до 48 часов.

Этап 3: Подсчёт. Подсчитывают все характерные колонии (тёмно-красные с металлическим блеском, розовые, красные). Для подсчёта выбирают чашки, где число колоний от 15 до 300. Результат рассчитывают по формуле:

X = (Σa × 10ⁿ) / V

где Σa — сумма колоний на всех чашках одного разведения, n — степень разведения, V — объём посева (см³).

Этап 4: Подтверждение. Отбирают не менее 5 колоний каждого типа. Проводят:

Оксидазный тест: наносят каплю реактива на фильтровальную бумагу, переносят часть колонии стеклянной палочкой. Появление сине-фиолетового окрашивания в течение 30-60 секунд — положительный результат (не БГКП). БГКП — оксидазоотрицательные.
Окраска по Граму: БГКП — грамотрицательные палочки (розовые/красные).
Ферментация лактозы: пересев в среду Гисса с лактозой, инкубация 24-48 ч при (36±1)°С. Положительный результат — помутнение и газ в поплавке.

Колонии, подтверждённые как БГКП (оксидазоотрицательные, грамотрицательные, ферментирующие лактозу с газом), учитывают в подсчёте.

Метод 2 (НВЧ-метод)

Этап 1: Посев. Из разведений 10⁻¹, 10⁻², 10⁻³ (или других, в зависимости от ожидаемой обсеменённости) вносят по 1 см³ в пробирки со средой Кесслер (по 5 пробирок на каждое разведение — схема 3×5, допускается 3×3). Инокулят погружают в толщу среды.

Этап 2: Инкубация. Пробирки инкубируют при (36±1)°С в течение 24-48 часов.

Этап 3: Учёт. Положительные пробирки — помутнение и газ (≥10% объёма поплавка). Из каждой положительной пробирки делают высев петлёй на среду Эндо. После инкубации 24 часа при (36±1)°С проверяют наличие характерных колоний. Пробирки, из которых на Эндо выросли типичные колонии, считаются подтверждённо положительными.

Этап 4: Расчёт. По числу положительных пробирок в трёх разведениях определяют НВЧ по таблице (Приложение Б стандарта). Например: 5-5-3 → НВЧ = 920 КОЕ/г (доверительные пределы 350-2900).

Метод 3 (качественное выявление)

Посев навески (обычно 1 г или 0,1 г) в пробирку с 10 см³ среды Кесслер (двойной концентрации для навесок >1 см³). Инкубация 24-48 ч при (36±1)°С. При наличии помутнения и газа — пересев на Эндо, подтверждающие тесты (оксидаза, Грам, ферментация лактозы). Результат: «обнаружены в навеске X г» или «не обнаружены в навеске X г».

Обработка результатов

Критерии достоверности

Результаты метода 1 учитываются, если контрольные штаммы дали ожидаемые результаты;
Расхождение между параллельными чашками не должно превышать 20% от среднего значения (при числе колоний >30);
Для метода НВЧ — доверительные пределы по таблице.

Представление результатов

Количественный метод: результат выражают в КОЕ/г (см³) с указанием метода. Пример: 1,2 × 10³ КОЕ/г.
НВЧ-метод: результат выражают в НВЧ/г с указанием доверительных пределов. Пример: НВЧ = 240/г (95% ДИ: 100-720).
Качественный метод: «обнаружены/не обнаружены в навеске X г».

Интерпретация

Сравнение с нормативами, установленными ТР ТС 021/2011 «О безопасности пищевой продукции» и ТР ТС 033/2013 (для молочной продукции):

Для большинства продуктов: БГКП не допускаются в 0,1 г (для жидких) или 0,01 г (для твёрдых);
Для продуктов детского питания — не допускаются в 1,0 г;
Для сырых продуктов (мясо, рыба) — допускаются в пределах установленных норм (например, 1×10³ КОЕ/г для охлаждённого мяса).

Требования к квалификации персонала

К проведению анализа допускаются специалисты с высшим или средним специальным образованием по специальности «микробиология», «биология», «ветеринария» или «пищевая биотехнология», прошедшие обучение методам микробиологического контроля пищевых продуктов и имеющие опыт работы не менее 6 месяцев. Персонал должен владеть техникой асептики, методами микроскопии, уметь идентифицировать колонии на селективных средах. Рекомендуется ежегодная проверка квалификации (внутрилабораторный контроль) и участие в межлабораторных сличительных испытаниях (МСИ) не реже одного раза в год.

Требования безопасности

Все работы проводятся в микробиологической лаборатории с соблюдением требований ГОСТ Р 52905 (ISO 15190) и СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности»;
Работа с посевами — в ламинарном боксе класса II (A2 или B2);
Использование средств индивидуальной защиты: халат, перчатки, очки (при работе с иммерсионным маслом — не требуется);
Дезинфекция отработанного материала — автоклавирование при 121°С в течение 30 минут;
Утилизация биологических отходов — согласно СанПиН 2.1.7.2790-10.

Оценка неопределённости измерений

Стандарт рекомендует оценивать расширенную неопределённость измерений (U) с коэффициентом охвата k=2 (95% доверительный интервал). Типичные значения относительной расширенной неопределённости для метода 1 составляют 15-50% (в зависимости от уровня обсеменённости), для НВЧ-метода — 30-70% (определяется таблицей Мак-Креди). В протоколе испытаний рекомендуется указывать: «Неопределённость измерения не превышает ±50% при k=2».

Протокол испытаний

Протокол должен содержать:

идентификацию образца (наименование, номер партии, дата изготовления, дата отбора);
дату и время начала анализа;
метод анализа (указание на ГОСТ 31747-2012, использованный метод: 1, 2 или 3);
результаты с указанием единиц измерения;
заключение о соответствии/несоответствии нормативам;
фамилию и подпись исполнителя;
фамилию руководителя лаборатории (или лица, утвердившего протокол).

Связь с другими стандартами

ГОСТ 31747-2012 взаимосвязан со следующими документами:

ТР ТС 021/2011 — устанавливает нормативы содержания БГКП в пищевых продуктах;
ГОСТ 31904-2012 — правила отбора проб;
ГОСТ ISO 7218-2015 — общие требования к микробиологическим исследованиям;
ГОСТ 26670-91 — методы культивирования микроорганизмов;
ГОСТ 10444.15-94 — методы определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (смежный показатель);
ГОСТ 31746-2012 — методы выявления и определения количества Staphylococcus aureus;
ГОСТ 31659-2012 — методы выявления бактерий рода Salmonella.

Практические рекомендации

Для продуктов с высокой обсеменённостью (сырое мясо, свежая рыба) рекомендуется использовать метод 1 (посев на плотные среды) с разведениями до 10⁻⁵.
Для продуктов, где БГКП должны отсутствовать (стерилизованное молоко, детское питание), предпочтителен качественный метод 3 с навеской 1,0 г.
При использовании хромогенных сред необходимо проводить валидацию (сравнение с эталонными средами) для каждого типа продукта.
Для кисломолочных продуктов (pH 4,0-4,5) обязательна нейтрализация pH перед посевом — иначе возможны ложноотрицательные результаты.
При получении сомнительных результатов (рост на Эндо без характерной морфологии) — проводить дополнительные биохимические тесты (индол, цитрат Симмонса, реакция Фогес-Проскауэра) для дифференциации от Aeromonas и Vibrio.

Приложения (краткое содержание)

Приложение А: Составы и приготовление питательных сред (среда Кесслер, агар Эндо, агар Левина, среда Гисса).
Приложение Б: Таблица НВЧ для схемы посева 3×5 (5 пробирок на 3 разведения) и 3×3.
Приложение В: Схема подтверждающих тестов (блок-схема).
Приложение Г: Перечень референс-штаммов для контроля качества сред.
Приложение Д: Рекомендации по оценке неопределённости.

Заключение

ГОСТ 31747-2012 является ключевым методическим документом для санитарно-микробиологического контроля пищевой продукции в странах ЕАЭС. Стандарт обеспечивает воспроизводимость результатов между лабораториями, гармонизирован с международными подходами (ISO 4831, ISO 4832) и позволяет достоверно оценивать гигиеническое состояние продуктов по показателю БГКП — одному из важнейших санитарно-показательных микроорганизмов, индикатору фекального загрязнения и потенциального присутствия патогенных энтеробактерий.